Влияние высокой концентрации глюкозы на способность мезенхимальных стромальных клеток контролировать рост кровеносных сосудов

Повреждение эндотелиальных и гладкомышечных клеток, а также перицитов приводит к развитию тяжелых сосудистых патологий у пациентов с сахарным диабетом (СД) [1, 2]. Длительное пребывание клеток сосудистой стенки в условиях гипергликемии вызывает нарушение их функциональной активности и приводит к их гибели в результате апоптоза [3, 4]. Гипергликемия отрицательно влияет не только на зрелые клетки, но и на малодифференцированные прогениторные клетки. В частности, высокая концентрация глюкозы приводит к подавлению миграционной активности и апоптозу циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток. Это обусловливает нарушение роста кровеносных сосудов и развитие тяжелой ишемии конечностей у пациентов с СД [5].

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) жировой ткани (ЖТ) являются малодифференцированными прогениторными клетками, по своему фенотипу и дифференцировочным способностям сходными с МСК костного мозга [6]. МСК продуцируют множество факторов роста, включая VEGF, bFGF, PDGF-BB, HGF и TGF-β, которые стимулируют рост и созревание кровеносных сосудов [7, 8]. Благодаря этому МСК из ЖТ (МСК-ЖТ) являются перспективными кандидатами для разработки методов аутологичной клеточной терапии при тяжелой ишемии тканей, включая ишемию конечностей у пациентов с СД. Однако влияние гипергликемии на способность МСК-ЖТ стимулировать рост кровеносных сосудов до сих пор не было изучено. Это может оказаться критичес­ким моментом, определяющим возможность использования аутологичных МСК-ЖТ у пациентов с СД.

Целью данного исследования являлось изучение влияния длительной инкубации в среде с высокой концентрацией глюкозы на функциональную активность МСК-ЖТ человека, в частности, на их способность стимулировать рост кровеносных сосудов.

Материалы и методы

Выделение и культивирование МСК-ЖТ

МСК были выделены из ЖТ взрослых доноров без СД, полученной с помощью ферментативной обработки в ходе плановых хирургических вмешательств [6]. МСК-ЖТ были культивированы в стандартном инкубаторе клеток в среде, поддерживающей рост недифференцированных мезенхимальных клеток (HyClone, Logan, UT, USA), содержащей 10% ростовой добавки (HyClone), 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина. Клетки пассировали при достижении монослоя с помощью обработки раствором ферментов (HyQ-Tase, HyClone). После первого пассирования клетки помещали на 10–12 дней в условия 5мМ или 25мМ концентрации глюкозы (высокую концентрацию создавали, добавляя в среду роста D-глюкозу (Sigma Aldrich)). Среду роста меняли каждые 3 дня.

Цитофлюориметрия в потоке

Для анализа экспрессии поверхностных маркеров МСК-ЖТ снимали с подложки с помощью р-ра Версена (ПанЭко). 0,5–1×105 клеток в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) были инкубированы с 2 мкл антител мыши против антигенов человека: CD73-PE, CD90-CyChrome (BD Biosciences, Bedford, MA, USA), CD105-FITC или CD49a-Alexa488 (Serotec, Oxford, UK). Соответствующее количество изотипических иммуноглобулинов использовали в качестве контроля. Для анализа клеточного цикла клетки фиксировали в 70% этаноле в течение 2 ч при -20°С и окрашивали Hoechst33342 (10 мкМ, Applichem, Darmstadt, Germany) или йодидом пропидия (PI, 25 мкМ Invitrogen) в ФСБ, содержащем 0,2 мг/мл РНКазы А (Invitrogen) и 0,1% Тритона-X-100 в течение 30 минут при комнатной температуре. Для оценки связывания аннексина V и накопления красителя 7-AAD 2-5×105 клеток в 400 мкл буфера для связывания с аннексином V с 10 мкл аннексина V, конъюгированного с фикоэритрином, и 20 мкл 7-аминоактиномицина (7-AAD) и инкубированы в течение 15 мин при комнатной температуре. Клетки, связывающие аннексин V и не накапливающие 7-AAD, считали как клетки в апоптозе. Клетки, накапливающие только 7-AAD, считали погибшими в результате некроза.

Формирование капилляроподобных структур эндотелиальными клетками

Эндотелиальные клетки вены пуповины человека (HUVEC) были любезно предоставлены О.А. Антоновой (ФГУ РКНПК, г. Москва). HUVEC культивировали в среде DMEM, содержащей 10% ФБС (HyClone), 200 мкг/мл ECGF (RELIA Tech GmbH, Germany), 5 Ед/мл гепарина, 1мМ пирувата Na (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA), 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (GIBCO BRL) и 20мМ HEPES (Helicon). Формирование капилляроподобных структур HUVEC в присутствии концентрированной в 40 раз кондиционированной среды роста МСК-ЖТ оценивали, как описано ранее [9]. Суммарную длину структур подсчитывали в 5 полях зрения, используя программу MetaMorph 7.1 (Universal Imaging, Downingtown, PA, USA). Достоверность различий анализировали с помощью U-критерия Манна-Уитни, различия с p<0,05 считали статистически значимыми.

Анализ гликозилирования белков с помощью флюоресцентной спектроскопии

Для этого анализа белки из кондиционированной среды МСК-ЖТ были концентрированы в 130 раз, используя 10кДа концентраторы. Поглощение при 280 нм и коэффициент экстинкции 1 (мг/мл)-1см-1 были использованы для выравнивания концентраций белка в образцах. Для измерений спектра флюоресценции использовали 0,5 мг/мл белка в 10мМ ФБС. Спектры возбуждения и испускания флюоресценции анализировали на флюоресцентном спектрометре LS 55 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Гликозилирование альбумина и других белков сыворотки определяли по усилению флюоресценции и/или ее сдвигу в сторону красной области спектра [10, 11].

Количественные ПЦР-арреи

Общая РНК была выделена из МСК-ЖТ с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), в соответствии с прилагаемой инструкцией. Геномная ДНК была удалена с помощью свободной от РНКаз ДНКазой (Qiagen). Анализ экспрессии ангиогенных факторов проводили согласно протоколу RT2 Profiler PCR Array (SABiosciences, Frederik, MD, USA). Для этого 2 мкг РНК из каждого образца было конвертировано в кДНК с использованием набора для синтеза первой цепи RT2 First Strand Kit (SABiosciences) и в составе смеси для ПЦР нанесено на 96-луночный планшет Angogenesis PCR Array (cat. # PAHS-024, SABiosciences). Амплификация специ­фичных продуктов была проанализирована на приборе iQ5 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Среднее количес­тво пороговых циклов Ct, полученных при амплификации генов «домашнего хозяйства» (B2m, Rpl13a, G3pd и Ps1tp5bp1), использовали для определения относительного порогового цикла измеряемого гена (ΔCt) в каждой лунке. Различия между значениями ΔCt МСК-ЖТ, культивированных в условиях 5 или 25мМ содержания глюкозы (ΔΔCt), были проанализированы с помощью непараметрического теста Вилкоксона [12].

Результаты и обсуждение

Высокая концентрация глюкозы не влияет на пролиферацию и апоптоз МСК-ЖТ

Мы предположили, что высокая концентрация глюкозы может влиять на содержание МСК-ЖТ, а также на пролиферацию и апоптоз этих клеток. При культивировании в условиях нормогликемии доля МСК, несущих маркерные антигены CD105+/CD73+ [13], составляет 58±8% МСК-ЖТ 2 пассажа. Кроме того, 18±7% этих клеток содержали маркеры МСК с высоким клоногенным потенциалом, CD49a+/CD73+ [14]. Инкубация в присутствии 25мМ глюкозы не влияла на содержание МСК в популяции (56 ± 9% и 14 ± 6% для CD105+/CD73+ и CD49a+/CD73+ соответственно). При анализе пролиферации и апоптоза этих клеток мы обнаружили, что около 20% МСК-ЖТ 2 пассажа находятся в активных фазах клеточного цикла (S+G2+M). Содержание пролиферирующих клеток при инкубации в условиях 5 или 25мМ глюкозы не различалось (14±3,1% и 14,6±4,3% при 5 и 25мМ глюкозы соответственно). Около 0,3% МСК-ЖТ 2 пассажа находились на ранних стадиях апоптоза (связывали аннексин V). Инкубация в условиях высокой концентрации глюкозы не влияла на содержание апоптозных клеток в популяции МСК-ЖТ (0,3±0,09% и 0,26±0,08% при 5 и 25мМ глюкозы соответственно). Влияние высокой концентрации глюкозы на пролиферацию и апоптоз в большой степени зависит от типа клеток. Так, высокая концентрация глюкозы стимулирует рост гладкомышечных клеток крысы и клеток кортикальных канальцев мыши, но подавляет пролиферацию и жизнеспособность эндотелиальных клеток, мезенхимальных клеток костного мозга и МСК-ЖТ крысы [3]. Кроме того, гипергликемия in vivo вызывает массовый апоптоз перицитов, приводя к развитию диабетической ретинопатии [15, 16].

Высокая концентрация глюкозы подавляет ангиогенный потенциал МСК-ЖТ

Ранее в нашей лаборатории и в других коллективах было показано, что МСК-ЖТ стимулируют рост кровеносных сосудов посредством продукции цитокинов и факторов роста, которые индуцируют миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток [17, 9]. Кондиционированная среда МСК-ЖТ, культивированных в среде, содержащей 5мМ глюкозы, стимулировала формирование капилляроподобных структур HUVEC. Однако среда клеток, культивированных в присутствии 25мМ глюкозы, в 3 раза хуже стимулировала формирование сосудистых структур in vitro. Так, суммарная длина капилляроподобных структур, сформированных HUVEC в присутствии кондиционированной среды МСК-ЖТ, выращенных в условиях в присутствии 25мМ глюкозы, составила 5,3±0,9 по сравнению с 15,3±2,2 в присутствии кондиционированной среды клеток, содержащей 5мМ глюкозы (p=0,001). Ранее мы установили, что инкубация в присутствии 25мМ глюкозы подавляет миграцию HUVEC и формирование ими капилляроподобных структур [18], влияя, таким образом, на начальные этапы ангиогенеза: выстраивание тяжей эндотелиальных клеток, их ветвление и формирование просвета капилляров. Однако в данном исследовании наблюдаемое различие не могло быть вызвано концентрацией глюкозы в среде формирования капилляров HUVEC, поскольку конечная концентрация глюкозы при разбавлении концентрированной среды культивирования в 40 раз составила 5,125 мМ. Поскольку МСК-ЖТ продуцируют факторы роста, стимулирующие ранние этапы ангиогенеза, включая VEGF, bFGF и HGF, мы предположили, что высокая концентрация глюкозы вызывает нарушение продукции цитокинов и факторов роста этими клетками, что и приводит к снижению ангиогенного эффекта кондиционированной среды МСК-ЖТ.

Высокая концентрация глюкозы не повышает гликозилирование белков кондиционированной среды

Присутствие в среде гликозилированных белков может подавлять формирование капилляроподобных структур HUVEC [19]. Более того, секретируемые ангиогенные факторы могут быть инактивированы посредством гликозилирования. Таким образом, кондиционированная среда МСК-ЖТ, культивированных в присутствии 25мМ глюкозы, может обладать сниженным ангиогенным эффектом из-за гликозилирования содержащихся в ней белков. Однако мы не обнаружили различий в спектре флюоресценции белков кондиционированных сред МСК-ЖТ, культивированных в условиях 5 или 25мМ концентрации глюкозы. Эти данные указывают на то, что наблюдаемое снижение ангиогенного эффекта кондиционированной среды МСК-ЖТ не вызвано гликозилированием содержащихся в ней белков, включая ангиогенные факторы роста.

Высокая концентрация глюкозы влияет на экспрессию факторов, регулирующих ангиогенез

При анализе экспрессии ангиогенных факторов мы обнаружили, что МСК-ЖТ наиболее выраженно экспрессируют плацентарный фактор роста, VEGF-C, bFGF, IGF1, IL-6, IL-8, мидкин, TGF-β1, матриксные металлопротеазы 2 и 9, а также урокиназу (таблица 1). Эти клетки также содержали мРНК ингибиторов ангиогенеза, таких как тканевые ингибиторы металлопротеаз 1 и 2, а также тромбоспондины 1 и 2 (таблица 1). Инкубация в присутствии 25мМ концентрации глюкозы вызвала изменения экспрессии 19 из 84 проанализированных генов (22%) (p≤0,1 по сравнению с инкубацией в присутствии 5мМ глюкозы); из них экспрессия 13 генов была повышена и 6 – подавлена (таблица 1). Мы обнаружили повышение экспрессии ангиопоэтинов, aFGF и лептина при культивировании в среде с 25мМ глюкозы (таблица 1). Мы также обнаружили, что высокая концентрация глюкозы стимулирует экспрессию плазминогена, цинк-зависимой металлопротеазы APN, транскрипционного фактора HAND2 и 4 поверхностных рецепторов, включая нейропилины 1 и 2. Длительная инкубация МСК-ЖТ в условиях высокой концентрации глюкозы также вызвала одновременное снижение экспрессии металлопротеазы 9 (в 2,4 раза; p=0,1 по сравнению с 5мМ глюкозой) и повышение экспрессии тканевого ингибитора металлопротеазы 3 (в 2,6 раза; p=0,03 по сравнению с 5мМ глюкозой). Однако экспрессия других проангиогенных факторов роста или ингибиторов ангиогенеза, таких как тромбоспондин 1 и 2 или TIMP2 не изменялась под действием 25мМ глюкозы. Необходимо отметить, что экспрессия TIMP1, которая была на несколько порядков выше, чем экспрессия других ингибиторов металлопротеаз, при культивировании в среде с высокой концентрацией глюкозы не изменялась.

Ранее было показано, что высокая концентрация глюкозы влияет на экспрессию факторов, регулирующих ангиогенез, включая лептин, bFGF и ангиопоэтин в эндотелиальных и гладкомышечных клетках [20-22]. Это хорошо согласуется с нашими данными о том, что содержание мРНК лептина, bFGF и ангиопоэтина повышено в МСК-ЖТ, культивируемых в условиях гипергликемии. Высокая концентрация глюкозы может влиять на экспрессию генов посредством активации различных путей внутриклеточной сигнализации [23], включая мобилизацию внутриклеточного Ca2+ [17] и повышение продукции супероксид аниона NADPH-оксидазами [4]. Так, в микрососудистом эндотелии почек повышение входа глюкозы в клетку вызывало повышение экспрессии ангиопоэтина посредством образования метилглиоксаля. Такое увеличение экспрессии ангиопоэтина повышало чувствительность микрососудистых эндотелиальных клеток к провоспалительному действию TNF-α [22]. Одновременное повышение экспрессии TNF-α и ангиопоэтина в МСК-ЖТ, культивируемых в условиях 25мМ концентрации глюкозы, может, таким образом, стимулировать апоптоз HUVEC и объяснять подавление формирования капилляров. Более того, глюкоза может влиять на продукцию и активацию секретируемых факторов. Так, высокая концентрация глюкозы влияет на эффективность трансляции мРНК тромбоспондина, подавляя секрецию этого фактора [24]. Кроме того, мы показали, что высокая концентрация глюкозы подав­ляет экспрессию матриксной металлопротеазы 9 и стимулирует экспрессию TIMP3. Поскольку ангиогенные факторы роста, включая TGF-β, секретируются в латентной форме и требуют протеолитической активации, снижение околоклеточной протеазной активности в условиях гипергликемии может обусловливать подавление способности кондиционированной среды МСК-ЖТ стимулировать формирование капилляроподобных структур.

Выводы

Длительная инкубация в условиях высокой концентрации глюкозы подавляет ангиогенные свойства МСК-ЖТ посредством изменения экспрессии активаторов и ингибиторов ангиогенеза. Поскольку МСК-ЖТ представлены в значительной степени перицитами, можно предполагать, что подавление ангиогенной активности перицитов в условиях гипергликемии является одной из причин недостаточного адаптивного ангиогенеза у пациентов с СД, способствующего развитию ишемии конечностей и миокарда.

Исследование проводили при поддержке Министерства образования и науки – грант № 02.527.11.0007 и №02.740.11.0307, а также Российского Фонда фундаментальных исследований – грант №08-04-01284-а и №09-04-12132-офи_м.