引用本文： 赵聪琳, 周永召, 杨洋, 蒙春莉, 刘凯. 宏基因组学二代测序在结核病诊断中的应用现状及发展前景. 中国呼吸与危重监护杂志, 2022, 21(9): 674-677. doi: 10.7507/1671-6205.202207067 复制
结核病是一种严重威胁人类健康的传染性疾病，2020年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指出全球新发结核病患者约为996万，其中结核病死亡人数约141万。中国是结核病的高发国家之一，约占全球结核病总数的8.5%[1]。近年来，耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的出现，给结核患者的治疗带来了新的难题[2]。MDR-TB患者治疗总周期长，药物不良反应多，治愈率较低，严重影响患者的生活质量[3]。早期的诊断和治疗是改善结核病患者预后的关键环节。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）复合群的病原微生物检测方法主要包括培养、涂片镜检、Xpert MTB/RIF检测等[4-7]。MTB培养是诊断结核病的金标准，但其敏感性低、耗时长，不能满足快速临床诊断的需求[8]。WHO推荐Xpert MTB/RIF检测法作为一线诊断技术并协助MDR-TB的管理[2]，但在不同类型的标本中，Xpert MTB/RIF的特异性及敏感性差异较大，虽然在肺外样本MTB的检测中具有较高的特异性，但其敏感性有限[9]。
由于传统微生物学诊断方法具有较大的局限性，及时、准确地诊断MTB感染较为困难。近年来，随着分子生物技术的发展，宏基因组学二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在临床中得到了广泛的应用。mNGS直接对样本中的核酸序列进行高通量测序，不依赖于传统病原微生物的培养，可以快速提供大量的病原学信息，包括病原微生物种属、菌株、耐药信息等，是一种高效灵敏的病原微生物诊断方法[10]，在结核病的快速诊断方面显示出良好的临床应用价值[5-6]。与传统培养和Xpert MTB/RIF方法相比，mNGS在提高MTB检测的敏感性和提供混合感染病原学信息方面具有优势[7]。此外，mNGS与培养或Xpert MTB/RIF相结合可进一步提高MTB的检测潜力[8]。
1 mNGS在肺结核诊断中的应用现状
肺结核占结核病病例的80%，早期诊断肺结核对于预防疾病进展和改善预后至关重要。mNGS在肺结核诊断中，总体敏感性为44%～59.9%，特异性为88.9%～100%，优于传统的病原学检查方法[9]。对于肺结核患者，常见的样本类型包括痰液、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、肺组织和血液等[10]。痰液mNGS检测的敏感性高于痰培养[11]，并且可以快速识别MDR-TB [12]。但是，在痰液标本中易混入上呼吸道定植菌，因此仅通过痰液mNGS结果区分感染与定植较为困难[13]。下呼吸道是一个相对无菌的解剖位置，BALF mNGS可提高病原体检测的敏感性，为临床诊断和治疗提供指导[14]。mNGS在BALF与肺组织样本中的诊断准确性差异无统计学意义，因此当BALF在特殊部位获取病原学价值有限或者存在纤维支气管镜操作禁忌证的患者，可选择肺组织作为mNGS的检测样本[15]。由于肺结核患者血液中可检测到的MTB序列数量较少，血液mNGS的敏感性较低，故通常不采用血液作为肺结核患者mNGS的首选样本[16]。综上，mNGS可以作为疑似肺结核患者MTB的有效检测方法，并推荐选择BALF或肺组织作为首选的样本类型[17]。mNGS的检测目标为核酸序列，抗结核治疗时间小于3个月不影响mNGS对MTB检出的敏感性；但长期抗结核治疗后，样本的MTB负荷便会减少，从而使mNGS敏感性降低[18]。因此，在抗生素治疗前进行收集样本和诊断检测具有重要意义。
临床上，肺结核患者通常合并真菌感染，如烟曲霉、白色念珠菌、肺炎隐球菌等[19]。合并感染患者临床表现多不典型，推荐将mNGS与血清学检测相结合以提高合并感染诊断的准确性[9]。此外，全面评估结核病患者微生物群特征，探究患者微生态特征与临床特征之间的关联，对于结核病的诊断和治疗十分重要。遗憾的是目前关于结核病患者整体病原微生态的研究较少，探索结核病患者病原微生态具有重要的临床意义，可以为疾病精确诊断和治疗提供新的思路[20]。
MTB是一种细胞内细菌，其特点是向细胞外释放的核酸序列较少，因此mNGS只需检测到1条属水平的MTB核酸序列，即判断为阳性[21]。mNGS使用单一的检测方法识别多种病原体的能力显示了其发现混合感染的潜力，然而呼吸道样本的定植微生物会使mNGS结果的解释复杂化[11]。因此，mNGS阳性结果的临床解释必须与患者临床特征、影像学资料、实验室检查相结合[22]。
2 mNGS在肺外结核诊断中的应用
结核包括肺结核和肺外结核[23]，肺外结核的比例在全球范围内逐渐升高[24]。结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）患者每年约占所有新发结核病例的1%～5%[25]，是肺外结核最严重的类型，诊断和治疗的延误可能导致25%的患者预后较差[26]。mNGS在TBM的诊断中敏感性、特异性较高[27]，可以作为TBM的一线检测手段。首次腰穿获得的脑脊液，其mNGS检测敏感性最高[28]。脑脊液中白细胞和蛋白水平升高或葡萄糖比值降低的患者，其mNGS出现阳性结果的可能性更大[29]。虽然mNGS提高了TBM的诊断效能，由于脑脊液中MTB负荷较低，mNGS不能作为TBM排除性诊断的检测手段[30]，因此mNGS联合其他诊断手段对临床工作的指导意义更大[31]。除了MTB外，mNGS还可以检测其他病原微生物，有助于脑膜炎的鉴别诊断[32]。尽管如此，mNGS在临床应用中也面临着巨大挑战，包括信息解读、样本选择等。目前关于mNGS在TBM中的应用研究较少，且部分结果存在争议[27]，因此需要更多的研究来明确mNGS在中枢神经系统感染中的应用规范和临床价值[29]。
此外，有部分研究也揭示了mNGS在其他类型肺外结核病诊断中的临床价值。mNGS在浆液病原体检测方面优于Xpert MTB/RIF[33]，结核性胸膜炎和结核性心包炎患者的胸水及心包积液中可检测出MTB[28]。同时，mNGS在骨关节结核的诊断和合并感染的诊断等方面具有较大的应用前景 [34]。
3 mNGS对耐药MTB的鉴定
随着耐药结核的日益增多，结核病的治疗难度不断增大，对MTB致病及耐药机制的研究十分重要[35]。当前有多种方法可以检测MTB的药物敏感性，如表型分析、基因分型分析等，但其在临床应用过程中存在一定的局限性，不能满足临床工作的需求[36]。随着分子诊断技术的不断发展，mNGS可以快速识别多个耐药相关的基因靶点，提高耐药结核的检测效率和准确性[37]。目前的临床研究主要集中在mNGS对于病原微生物的鉴定，mNGS耐药基因检测的报道较少，已有的报道指出可以使用mNGS技术来进行MTB的耐药性分析[38-39]，进行MTB耐药性的监测，指导抗结核药物的选择[40]，具有临床应用潜能。在MTB耐药性分析方面，mNGS需在检测出病原微生物后才能进行细菌耐药性的检测[41]，分子耐药基因诊断缺乏足够的耐药基因和耐药表型的临床研究数据，目前尚无标准化且全面的耐药基因位点及突变信息。此外，mNGS不能确定耐药基因来自于致病病原体或非致病致病菌[42-43]，在耐药基因的检测方面仍需要不断进行技术以及流程优化[9]。
综上所述，mNGS在结核病的快速诊断方面显示出了良好的临床价值，但在临床应用过程中，仍然面对较多挑战。首先，mNGS采集、运输及检测过程中可能存在定植菌的污染，导致结果的假阳性[44]。其次，缺乏结果判读的统一标准，包括阈值的设定等，在解释和分析数据方面较为困难[45]。此外，MTB的基因序列内部同源性较高，物种特异性序列较少，很难鉴定MTB菌株，必要时需联合聚合酶链反应来进一步鉴定结核菌株[46]，mNGS的应用规范需要在临床实践中不断验证与完善。在病原微生物检测方面，mNGS在某些方面具有独特的优势，但是其同时也存在一定的局限性，因此，临床医生需要根据患者实际情况在合适的时机选择合适的样本进行mNGS检测，通过合理的结果解释及分析，提高结核的诊断效率和准确性[47]。随着宏基因组学三代测序和靶向测序等分子检测方法的发展，结核病诊断的准确性将得到了进一步的提升，有望更好地辅助结核病的临床诊断和治疗。
利益冲突：本文不涉及任何利益冲突。
结核病是一种严重威胁人类健康的传染性疾病，2020年，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）指出全球新发结核病患者约为996万，其中结核病死亡人数约141万。中国是结核病的高发国家之一，约占全球结核病总数的8.5%[1]。近年来，耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的出现，给结核患者的治疗带来了新的难题[2]。MDR-TB患者治疗总周期长，药物不良反应多，治愈率较低，严重影响患者的生活质量[3]。早期的诊断和治疗是改善结核病患者预后的关键环节。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）复合群的病原微生物检测方法主要包括培养、涂片镜检、Xpert MTB/RIF检测等[4-7]。MTB培养是诊断结核病的金标准，但其敏感性低、耗时长，不能满足快速临床诊断的需求[8]。WHO推荐Xpert MTB/RIF检测法作为一线诊断技术并协助MDR-TB的管理[2]，但在不同类型的标本中，Xpert MTB/RIF的特异性及敏感性差异较大，虽然在肺外样本MTB的检测中具有较高的特异性，但其敏感性有限[9]。
由于传统微生物学诊断方法具有较大的局限性，及时、准确地诊断MTB感染较为困难。近年来，随着分子生物技术的发展，宏基因组学二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）在临床中得到了广泛的应用。mNGS直接对样本中的核酸序列进行高通量测序，不依赖于传统病原微生物的培养，可以快速提供大量的病原学信息，包括病原微生物种属、菌株、耐药信息等，是一种高效灵敏的病原微生物诊断方法[10]，在结核病的快速诊断方面显示出良好的临床应用价值[5-6]。与传统培养和Xpert MTB/RIF方法相比，mNGS在提高MTB检测的敏感性和提供混合感染病原学信息方面具有优势[7]。此外，mNGS与培养或Xpert MTB/RIF相结合可进一步提高MTB的检测潜力[8]。
1 mNGS在肺结核诊断中的应用现状
肺结核占结核病病例的80%，早期诊断肺结核对于预防疾病进展和改善预后至关重要。mNGS在肺结核诊断中，总体敏感性为44%～59.9%，特异性为88.9%～100%，优于传统的病原学检查方法[9]。对于肺结核患者，常见的样本类型包括痰液、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、肺组织和血液等[10]。痰液mNGS检测的敏感性高于痰培养[11]，并且可以快速识别MDR-TB [12]。但是，在痰液标本中易混入上呼吸道定植菌，因此仅通过痰液mNGS结果区分感染与定植较为困难[13]。下呼吸道是一个相对无菌的解剖位置，BALF mNGS可提高病原体检测的敏感性，为临床诊断和治疗提供指导[14]。mNGS在BALF与肺组织样本中的诊断准确性差异无统计学意义，因此当BALF在特殊部位获取病原学价值有限或者存在纤维支气管镜操作禁忌证的患者，可选择肺组织作为mNGS的检测样本[15]。由于肺结核患者血液中可检测到的MTB序列数量较少，血液mNGS的敏感性较低，故通常不采用血液作为肺结核患者mNGS的首选样本[16]。综上，mNGS可以作为疑似肺结核患者MTB的有效检测方法，并推荐选择BALF或肺组织作为首选的样本类型[17]。mNGS的检测目标为核酸序列，抗结核治疗时间小于3个月不影响mNGS对MTB检出的敏感性；但长期抗结核治疗后，样本的MTB负荷便会减少，从而使mNGS敏感性降低[18]。因此，在抗生素治疗前进行收集样本和诊断检测具有重要意义。
临床上，肺结核患者通常合并真菌感染，如烟曲霉、白色念珠菌、肺炎隐球菌等[19]。合并感染患者临床表现多不典型，推荐将mNGS与血清学检测相结合以提高合并感染诊断的准确性[9]。此外，全面评估结核病患者微生物群特征，探究患者微生态特征与临床特征之间的关联，对于结核病的诊断和治疗十分重要。遗憾的是目前关于结核病患者整体病原微生态的研究较少，探索结核病患者病原微生态具有重要的临床意义，可以为疾病精确诊断和治疗提供新的思路[20]。
MTB是一种细胞内细菌，其特点是向细胞外释放的核酸序列较少，因此mNGS只需检测到1条属水平的MTB核酸序列，即判断为阳性[21]。mNGS使用单一的检测方法识别多种病原体的能力显示了其发现混合感染的潜力，然而呼吸道样本的定植微生物会使mNGS结果的解释复杂化[11]。因此，mNGS阳性结果的临床解释必须与患者临床特征、影像学资料、实验室检查相结合[22]。
2 mNGS在肺外结核诊断中的应用
结核包括肺结核和肺外结核[23]，肺外结核的比例在全球范围内逐渐升高[24]。结核性脑膜炎（tuberculous meningitis，TBM）患者每年约占所有新发结核病例的1%～5%[25]，是肺外结核最严重的类型，诊断和治疗的延误可能导致25%的患者预后较差[26]。mNGS在TBM的诊断中敏感性、特异性较高[27]，可以作为TBM的一线检测手段。首次腰穿获得的脑脊液，其mNGS检测敏感性最高[28]。脑脊液中白细胞和蛋白水平升高或葡萄糖比值降低的患者，其mNGS出现阳性结果的可能性更大[29]。虽然mNGS提高了TBM的诊断效能，由于脑脊液中MTB负荷较低，mNGS不能作为TBM排除性诊断的检测手段[30]，因此mNGS联合其他诊断手段对临床工作的指导意义更大[31]。除了MTB外，mNGS还可以检测其他病原微生物，有助于脑膜炎的鉴别诊断[32]。尽管如此，mNGS在临床应用中也面临着巨大挑战，包括信息解读、样本选择等。目前关于mNGS在TBM中的应用研究较少，且部分结果存在争议[27]，因此需要更多的研究来明确mNGS在中枢神经系统感染中的应用规范和临床价值[29]。
此外，有部分研究也揭示了mNGS在其他类型肺外结核病诊断中的临床价值。mNGS在浆液病原体检测方面优于Xpert MTB/RIF[33]，结核性胸膜炎和结核性心包炎患者的胸水及心包积液中可检测出MTB[28]。同时，mNGS在骨关节结核的诊断和合并感染的诊断等方面具有较大的应用前景 [34]。
3 mNGS对耐药MTB的鉴定
随着耐药结核的日益增多，结核病的治疗难度不断增大，对MTB致病及耐药机制的研究十分重要[35]。当前有多种方法可以检测MTB的药物敏感性，如表型分析、基因分型分析等，但其在临床应用过程中存在一定的局限性，不能满足临床工作的需求[36]。随着分子诊断技术的不断发展，mNGS可以快速识别多个耐药相关的基因靶点，提高耐药结核的检测效率和准确性[37]。目前的临床研究主要集中在mNGS对于病原微生物的鉴定，mNGS耐药基因检测的报道较少，已有的报道指出可以使用mNGS技术来进行MTB的耐药性分析[38-39]，进行MTB耐药性的监测，指导抗结核药物的选择[40]，具有临床应用潜能。在MTB耐药性分析方面，mNGS需在检测出病原微生物后才能进行细菌耐药性的检测[41]，分子耐药基因诊断缺乏足够的耐药基因和耐药表型的临床研究数据，目前尚无标准化且全面的耐药基因位点及突变信息。此外，mNGS不能确定耐药基因来自于致病病原体或非致病致病菌[42-43]，在耐药基因的检测方面仍需要不断进行技术以及流程优化[9]。
综上所述，mNGS在结核病的快速诊断方面显示出了良好的临床价值，但在临床应用过程中，仍然面对较多挑战。首先，mNGS采集、运输及检测过程中可能存在定植菌的污染，导致结果的假阳性[44]。其次，缺乏结果判读的统一标准，包括阈值的设定等，在解释和分析数据方面较为困难[45]。此外，MTB的基因序列内部同源性较高，物种特异性序列较少，很难鉴定MTB菌株，必要时需联合聚合酶链反应来进一步鉴定结核菌株[46]，mNGS的应用规范需要在临床实践中不断验证与完善。在病原微生物检测方面，mNGS在某些方面具有独特的优势，但是其同时也存在一定的局限性，因此，临床医生需要根据患者实际情况在合适的时机选择合适的样本进行mNGS检测，通过合理的结果解释及分析，提高结核的诊断效率和准确性[47]。随着宏基因组学三代测序和靶向测序等分子检测方法的发展，结核病诊断的准确性将得到了进一步的提升，有望更好地辅助结核病的临床诊断和治疗。
利益冲突：本文不涉及任何利益冲突。