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Introducción
COVID-19 surge en el mundo a finales de 2019 en China y fue declarada pandemia en marzo de 2020 por la OMS. Desde entonces, ha evolucionado en varias olas epidémicas en prácticamente todos los países, confirmándose en el momento de escribir este artículo, más de 500 millones de casos y más de 6 millones de muertes en todo el mundo1. Para controlar la pandemia, los países han optado por diferentes medidas y estrategias para contener la acelerada progresión en el número de casos. A pesar de ello, persiste una intensa circulación viral, agravada por la aparición de diferentes variantes del virus SARS-CoV-2 con mayor transmisibilidad o evasión inmune.
Sin duda, el diagnóstico masivo y oportuno, con el objetivo de identificar a los transmisores, es una de las estrategias más críticas para el control. La identificación de casos de COVID-19 se ha basado principalmente en el uso de las técnicas de reacción de polimerasa en cadena (RPC) cuantitativa con transcripción reversa (en inglés: RT-qPCR) en HNF, muestra considerada como el estándar de oro, principalmente por el papel en el diagnóstico de otros patógenos respiratorios2. Sin embargo, al necesitar pruebas masivas, frecuentes y rápidas, este método tiene algunas dificultades. Algunas de ellas fueron inicialmente el quiebre de stock de suministros de muestreo, adicionado a la necesidad de tener personal capacitado, el uso de equipos de protección personal (EPP) y, en la percepción del paciente, las molestias asociadas con el muestreo, especialmente en la población pediátrica y en aquellos que deben someterse a las pruebas en varias ocasiones por motivos de trabajo o viaje.
Para hacer frente a estas dificultades, la muestra de saliva para el diagnóstico ha surgido como una alternativa al HNF, debido a la facilidad de muestreo, e incluso puede ser auto-tomada. En este escenario de auto-toma, las ventajas del uso de saliva sobre el HNF son más relevantes al no necesitar de personal capacitado ni de EPP. Varios estudios han evaluado su desempeño como recurso diagnóstico, aunque los resultados son diversos debido a la falta de estandarización en la fase pre-analítica3–5.
Diversos estudios que evalúan la utilidad de la saliva para el diagnóstico se basan en pacientes hospitalizados con un pequeño número de participantes6,7. Por esta razón, decidimos evaluar la utilidad de la saliva como muestra diagnóstica de COVID-19 utilizando RT-qPCR SARS-CoV-2 en una población de sujetos consultantes en el ámbito ambulatorio, en comparación con HNF como estándar de oro.
Materiales y Métodos
Diseño
Se trata de un estudio transversal, durante dos momentos de la pandemia en Chile, uno de baja y otro de alta transmisión comunitaria (número reproductivo 0,7 y 1,5, respectivamente) de septiembre de 2020 a marzo de 2021. Durante el primer período predominó la cepa ancestral B1 y Wuhan, y durante el segundo período la variante gamma P1. Todos los participantes fueron consultantes en dos centros de diagnóstico ambulatorio y tres Servicios de Urgencia de la Red de Salud UC-CHRISTUS, en Santiago, Chile.
Participantes
Se invitó a participar a personas de 18 años y más, que consultaron por síntomas sugerentes de COVID-19 en el servicio de urgencias o que contaban con prescripción médica para realizar la prueba RPC de COVID-19 en las unidades de diagnóstico ambulatorio. Los participantes no debían haber consumido alimentos o líquidos, excepto agua, efectuado ni el lavado de dientes o fumado, en los 30 minutos previos a la toma de las muestras.
Procedimientos
Después de firmar el consentimiento informado, se tomó una muestra de saliva seguida de HNF. Los participantes con un resultado positivo recibieron un cuestionario en línea para evaluar la presencia y el tipo de síntomas y los días de progresión de la enfermedad. Además, el cuestionario evaluó la aceptabilidad de la muestra de saliva e HNF.
Recolección de muestras
El personal de salud instruyó a los participantes a salivar en un tubo Falcon® de 15 ml con 2 ml de medio de transporte universal (MTU). No se solicitó un volumen mínimo de saliva. Luego, la enfermera obtuvo la muestra de HNF también en un tubo Falcon con 2 ml de MTU. Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en el sitio de muestreo y se transfirieron al Laboratorio de Infectología y Virología Molecular en la Red Salud UCCHRISTUS a temperaturas entre 4 y 8° C.
RT-qPCR
En ambas muestras se realizó, en forma paralela, RT-qPCR de SARS-CoV-2. La extracción de ARN de saliva y del HNF se realizó en un sistema automatizado. Se utilizaron 250 μl de saliva, a los que previamente se añadieron perlas de vidrio y fueron agitadas por al menos 10 segundos. Para el proceso de extracción, se utilizó el kit Mag-Bind RNA extraction® (Maccura) en el equipo Auto-Pure32A Nucleic Acid Purification System® (Maccura). Como proceso de respaldo, se utilizó el kit DA0630 RNA-DNA Purification Kit (Magnetic Bead)® (Da An Gene) en el equipo Smart-32 (Da An Gene) y se corrió en paralelo con el Auto-Pure32A (Maccura).
Se agregó un control de extracción de ARN, que consiste en ARN del virus de la artritis equina (EAV), a cada muestra. Para la amplificación RT-qPCR, se utilizó el kit LightMix® SARS-CoV-2 RdRP plus EAV control (TibMolBiol, cat. 53-0777-96). Este RT-qPCR de un solo paso, está diseñado para amplificar un fragmento de 87 pb de longitud del gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN del SARS-CoV-2 (gen RdRP). La amplificación ocurre en un proceso de transcripción reversa (RT) y RPC en un solo paso en un termociclador en Tiempo Real, LightCycler® 480 II (ROCHE). En todas las corridas se incluyó un control negativo, un control positivo y un control interno que detecta el ARN de EAV.
Estimación de carga viral
Para cada muestra se registró el CT de RdRp como una aproximación a la carga viral y ésta se determinó con una curva estándar utilizando un calibrador comercial, Exact Diagnostics SARS-CoV-2 Standard®, número de catálogo SKU: COVID19, que contiene 200.000 copias/ ml de ARN viral de los genes E, N, ORF1ab, RdRP y S.
Utilizando la curva estándar, que considera en su cálculo no sólo el proceso de RT-PCR sino también la extracción de ácidos nucleicos, pudimos determinar con precisión la carga viral entre los CT 16 y 37. El límite superior de cuantificación es en el CT 16 y corresponde a una carga viral de 670.438.914 copias/ml. El límite inferior de cuantificación es en el CT 37 y corresponde a 1.523 copias/ml. El límite de detección (LDD) se fijó en CT = 40 ya que CT > 40 corresponde a una muestra negativa. El CT 40 está fuera del rango para calcular con precisión la carga viral a partir de la curva estándar. Si extrapolamos los valores de la curva, en CT 40 la concentración correspondería a aproximadamente 238 copias/ml, por lo que es probable que el LDD del ensayo esté alrededor de esa cifra.
Cabe destacar que la carga viral estimada a partir de los valores de CT es sólo una aproximación y que no considera la variabilidad propia de los distintos fluidos como la cantidad de células y volúmenes. Sin embargo, al llevar la detección de genoma viral a número de copias/mL, con ayuda de una curva estándar, nos permite hacer comparable una muestra con otra. La comparación de las cargas virales estimadas se realizó con los logaritmos, por tener menor variabilidad o incertidumbre que el valor absoluto en copias/ml.
El resultado del RT-qPCR se clasificó como positivo, indeterminado y negativo. Una muestra se definió como positiva con CT ≤ 37, indeterminada con valores de CT > 38 a 40 y negativa con CT> 40 o sin amplificación.
Análisis de datos
Se realizó un análisis estadístico descriptivo, incluyendo promedios y porcentajes. Las comparaciones bivariadas de variables categóricas y continuas se realizaron mediante pruebas de χ2 y t de student. Las variables continuas se expresaron como media y desviación estándar y se compararon mediante t-test pareado, de dos colas y la prueba paramétrica U-test Mann-Whitney indicada para tamaños muestrales pequeños y con distribución probablemente distinta de lo normal. Para estimar la sensibilidad, la especificidad, los valores predictores positivos (VPP), los valores predictores negativos (VPN), los cocientes de probabilidad, kappa de Cohen (coeficiente K) y sus intervalos de confianza (IC) de 95%, se excluyeron las muestras con resultado indeterminado. Se utilizó como estándar de oro el RT-qPCR en HNF. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p de dos colas < 0,05. Para los análisis gráficos, se utilizó el paquete Prism 6.
Tamaño muestral
El tamaño muestral requerido para la validación de RTqPCR SARS-CoV-2 utilizando una nueva matriz como la saliva, se basó en la recomendación del Instituto de Salud Pública de Chile (ISP) y el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) de incluir al menos 50 muestras verdaderamente positivas (VP) (detectadas positivas conjuntamente por el método de referencia y candidato) y 50 muestras negativas detectadas por el método de referencia8,9.
Resultados
Participantes
Durante el período de estudio, se reclutaron 536 individuos, entre 18 y 90 años, de los cuales 82,7% eran provenientes de las unidades de tomas de muestras. La edad media de los participantes fue de 41,5 años ± 14,9 y 262 eran mujeres (48,9%). Cincuenta y nueve participantes fueron diagnosticados con COVID-19 con un promedio de edad 43,5 ± 16,1 (22 - 83 años). Veintiocho eran mujeres (47,4%).
Muestreo de saliva y aceptabilidad
El volumen de saliva espontáneo recogido por 528 participantes fue en promedio 1,4 ml con una mediana de 1,5 ml (0,1-7,0 ml). El volumen promedio de saliva en 53 muestras positivas fue de 1,1 ml (0,1-3,0 ml), sin diferencias con el volumen recogido en las muestras negativas. Cuarenta (88,9%) de los 45 participantes que completaron la encuesta para casos de COVID-19 respondieron que preferían la saliva como muestra diagnóstica en comparación con HNF.
Rendimiento de RT-qPCR en muestras de saliva para el diagnóstico de COVID-19
Entre los 536 sujetos estudiados, la tasa de positividad de HNF fue de 11% (59 muestras), seis muestras fueron indeterminadas y 471 muestras negativas. En las muestras de saliva, la tasa de positividad fue de 10% (54 muestras), 2 indeterminadas y 480 negativas. La concordancia general fue de 526/536 (98%) entre los dos tipos de muestra. De las 10 muestras discordantes, 4 muestras de saliva fueron negativas con su par de HNF positivas, 1 muestra fue indeterminada con su par de HNF positiva y 5 fueron negativas con su par de HNF indeterminadas (Tabla 1).
Tabla 1 Resultados de RT-qPCR de SARS-CoV-2 en 536 muestras pareadas de HNF y saliva
| HNF | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Positivo | Negativo | Indeterminado | Total | ||
| Saliva | Positivo | 54 | 0 | 0 | 54 |
| Negativo | 4 | 471 | 5 | 480 | |
| Indeterminado | 1 | 0 | 1 | 2 | |
| Total | 59 | 471 | 6 | 536 | |
HNF = hisopado nasofaríngeo.
Cincuenta y nueve sujetos fueron diagnosticados con COVID-19 por HNF y 54 por muestras de saliva. De los 59 sujetos positivos, 42,4% provenía de las unidades de toma de muestra con orden médica de RPC COVID-19 y 57,6% de consulta en servicios de urgencia. La sensibilidad general de RT-qPCR en saliva fue 91,5% (IC 95%: 81,32-97,19%), la especificidad 100% (IC 95%: 99,23-100%), el VPP 100%, el VPN 98,2% (IC 95%: 87-99,20%), el LR negativo 0,08 (IC 95%: 0,04-0,20) y tuvo una precisión de 98,47% (IC 95%: 97,04-99,33%). Kappa de Cohen: 0,95.
La sensibilidad de la RPC en la saliva se redujo a 66,6% cuando el valor de CT en HNF fue ≥ 30, mientras que cuando el valor de CT en HNF fue < 30, la sensibilidad aumentó al 96%.
Análisis de CT y carga viral
Se analizaron en las muestras pareadas los valores de CT de RdRp, como aproximación de la carga viral de SARS-CoV-2, incluyendo resultados positivos e indeterminados (n = 65). Los valores promedios de CT en HNF y saliva fueron de 23,98 ± 7,65 (rango 14,29-40) y 27,97 ± 5,45 (rango 14,85-40), respectivamente, con una diferencia de 3,99 (IC 95%: 1,56 a 6,41), p < 0,0001 (Figura 1a). En 55 (84,6%) muestras pareadas, el valor de CT en HNF fue más bajo que en saliva, sugiriendo una carga viral más alta mientras que en 10 (18%) pares de muestra, la carga fue más alta en las muestras de saliva (Figura 2).
Figura 1 Comparación de los valores de CT y de carga viral del SARS-CoV-2 en muestras pareadas de HNF y saliva. (a) Los valores de CT del gen RdRP en HNF (puntos azules) y saliva (puntos rojos) en 65 pares de muestras, incluidos resultados positivos e indeterminados. El promedio de CT en HNF es de 23,98 y en saliva es de 27,97; (b) Carga viral en 59 pares de muestras. La CV media en HNF es Log 7,05 copias/ml, la CV media en saliva es Log 5,78 copias/ml. Las líneas horizontales son la media ± desviación estándar, CT = cycle threshold, HNF = hisopado nasofaríngeo, RdRP = ARN polimerasa dependiente de ARN.
Figura 2 Comparación de los valores de CT de RT-qPCR para SARS-CoV-2 en 65 pares de muestras de HNF y saliva. Valor de CT de RdRP para muestras pareadas de HNF (puntos azules) y saliva (puntos rojos). Cada línea representa el especimen correspondiente emparejado. La línea discontinua en CT = 40 corresponde al punto de corte del ensayo, CT = cycle threshold, HNF = hisopado nasofaríngeo, RdRP = ARN polimerasa dependiente de ARN.
La carga viral se analizó sólo en muestras positivas, el promedio en HNF fue Log 7,05 ± 1,68 en comparación con Log 5,78 ± 1,42 en saliva, p < 0,0001 (Figura 1b).
La media de CT en HNF, cuando tanto las muestras de HNF como las de saliva fueron positivas, fue menor en comparación a cuando sólo las muestras de HNF fueron positivas (21,86 ± 5,71 vs. 29,40 ± 9,45, p = 0,0580) (Figura 3). Nueve (15%) de los HNF positivos y 17 (31%) de las salivas positivas tuvieron un CT ≥ 30; IC 95%: 0,47 a 30,96, p = 0,043.
Figura 3 Comparación de los valores de CT de RdRP entre 59 muestras pareadas de HNF y saliva en casos de COVID-19. Valores de CT en HNF cuando tanto el HNF como la saliva fueron positivos (puntos azules), valores de CT de saliva cuando tanto HNF como saliva fueron positivos (puntos rojos) y valores de CT en HNF cuando sólo el HNF fue positivo (puntos verdes). Las líneas horizontales indican la media y la desviación estándar. La media para cada grupo es: 21,86 ± 5,71; 27,56 ± 5,1 y 29,40 ± 9,45, para HNF (ambos positivos), saliva (ambos positivos) e HNF (sólo HNF positivos), respectivamente. CT = cycle threshold, HNF = hisopado nasofaríngeo, RdRP = ARN polimerasa dependiente de ARN.
Pacientes con COVID-19
De los 59 casos de COVID-19, presentaron síntomas 56 (94,9%) pacientes. De éstos, 53 (95%) fueron positivos tanto en HNF como en saliva. Dos de los tres pacientes asintomáticos con HNF positivo tuvieron resultados negativos en saliva.
Al momento del diagnóstico, los sujetos sintomáticos presentaban en promedio 3,13 ± 3,01 días de síntomas, 37 (66%) se tomaron la RPC dentro de los primeros tres días del inicio de la enfermedad, 15 (27%) entre 4 y 7 días y 4 (7,1%) después de 7 días de síntomas.
El tipo y la proporción de síntomas en los 56 pacientes sintomáticos se muestran en la Tabla 2. Los síntomas más comunes fueron mialgias y cefalea. Los síntomas menos frecuentes fueron dolor abdominal y vómitos.
Tabla 2 Frecuencia de síntomas y valores de CT en 56 pacientes sintomáticos al momento del diagnóstico de COVID-19
| Síntomas | n | (%) | Valor CT HNF promedio ± DE | Valor CT saliva promedio ± DE |
|---|---|---|---|---|
| Sintomáticos | 56 | (100) | 22,09 ± 6,04a b | 27,77 ± 5,38 |
| Mialgias | 46 | (82,1) | 21,63 ± 5,73 | 27,85 ± 5,21 |
| Cefalea | 40 | (71,4) | 21,51 ± 5,73 | 27,6 ± 5,62 |
| Fiebre | 34 | (60,7) | 21,78 ± 6,31 | 28,52 ± 5,67 |
| Tos | 34 | (60,7) | 21,57 ± 6,42 | 26,97 ± 4,88 |
| Astenia | 32 | (57,1) | 22,74 ± 5,84 | 28,74 ± 4,46 |
| Coriza | 25 | (44,6) | 21,69 ± 6,15 | 29,17 ± 4,14 |
| Anorexia | 25 | (44,6) | 22,07 ± 5,76 | 28,91 ± 4,73 |
| Odinofagia | 22 | (39,3) | 18,99 ± 3,34a | 26,56 ± 3,85 |
| Calofríos | 22 | (39,3) | 21,96 ± 6,30 | 28,13 ± 4,54 |
| Anosmia | 15 | (26,8) | 21,93 ± 6,00 | 29,74 ± 4,87 |
| Ageusia | 14 | (25,0) | 21,88 ± 6.03 | 29,46 ± 5,42 |
| Dolor toráxico | 11 | (19,6) | 23,69 ± 6,91 | 29,53 ± 5.03 |
| Diarrea | 10 | (17,9) | 25,90 ± 5,73 | 27,61 ± 5,21 |
| Náuseas | 9 | (16,1) | 27,06 ± 5,82b | 30,32 ± 4,99 |
| Disnea | 8 | (14,2) | 23,55 ± 7,69 | 28,80 ± 3,93 |
| Disfonía | 8 | (14,2) | 18,71± 3,34 | 29,97 ± 3,15 |
| Dolor abdominal | 7 | (12,5) | 22,60 ± 5,75 | 29,20 ± 5,57 |
| Vómitos | 3 | (5,4) | 31,86 ± 7,32 | 29,40 ± 0,78 |
aDiferencia 3,1 (IC 95%: −5,8211 a −0,3789, p = 0,026);
bdif 4,97 (IC 95%: 0,6551 a 9,2849; p = 0,025).
Carga viral según sintomatología
Entre los 56 pacientes sintomáticos, el promedio de CT en HNF fue 22,09 ± 5,98 (rango 14,29-36,2) y en saliva fue 27,54 ± 5,15 (rango 14,85-40), con una diferencia de 5,45 (IC 95%: 3,33 a 7,57) (p < 0,0001). La carga viral promedio en HNF en pacientes sintomáticos fue Log 7,16 ± 1,59 vs. Log 5,72 ± 1,37 copias/ml, p < 0,0001 en saliva. El valor promedio de CT en HNF en sujetos asintomáticos fue de 30,21 ± 8,78, más alto que en los sujetos sintomáticos, aunque no se realizó el análisis estadístico por ser sólo tres sujetos.
La media de los valores de CT según el tipo de síntoma se muestran en la Tabla 2. En HNF los sujetos con odinofagia tuvieron la carga viral más alta, promedio Log 7,98 ± 0,84 copias/ml, y el valor más bajo de CT, 18,99 ± 3,34, p =0,025. Los sujetos sintomáticos que presentaron náuseas (promedio CV Log 5,85 ± 1,57 copias/ml y CT 27,06 ± 5,82) tuvieron el valor de CV más baja y CT más alto al comparar con el valor promedio en los sintomáticos (p = 0,025). Los sujetos con vómitos (promedio CV Log 4,56 ± 1,97 copias/ml y CT 31,86 ± 7,32) también mostraron cargas virales más bajas, aunque no se realizó análisis estadístico por ser sólo tres sujetos. En la saliva, esto también se observó, aunque sin significación estadística.
Carga viral según días de evolución
Los valores de CT en HNF y saliva fueron incrementando en la medida que aumentaron los días de síntomas. Tanto para HNF como para saliva, el valor más bajo de CT ocurrió un día antes del inicio de los síntomas en un sujeto, como se observa en la Figura 4a. Durante los primeros tres días de síntomas, en el HNF la media de CV fue Log 7,65 ± 1,56 y en saliva Log 5,98 ± 1,59. Después de siete días, en HNF disminuyó a Log 5,08 ± 1,52 y en saliva a Log 4,4 ± 0,47 con una diferencia estadísticamente significativa con p = 0,0119 y p = 0,0308, respectivamente. Los valores promedios de CT y CV entre HNF y saliva fueron estadísticamente diferentes dentro de los primeros siete días de los síntomas (Figura 4b). Los valores medios de CT y CV en HNF y saliva según los días de síntomas se muestran en la Tabla 3.
Figura 4 Valores CT de RdRP y de carga viral en HNF y saliva según días de síntomas. (a) Valores medios de CT en HNF (cuadrados azules) y saliva (triángulos rojos) de pacientes con COVID-19 según días de enfermedad. Las pendientes se calcularon mediante regresión lineal simple, pendiente HNF=0,8666 y pendiente de saliva= 0.5600 (b) Valores de CV en HNF (puntos azules) y saliva (puntos rojos) en distintos intervalos de días desde el inicio de los síntomas; 0-3 días, 4-7 días y > 7 días. Las líneas horizontales representan la media. En día 0-3, la media de CV para HNF es Log 7,65 y saliva Log 5,98; día 4-7 en HNF es Log 7,1 y saliva Log 5,46; día > 7 en HNF es Log 5,08 y saliva Log 4,4. CT = cycle threshold, HNF = hisopado nasofaríngeo, RdRP = ARN polimerasa dependiente de ARN.
Tabla 3 Comparación de los valores de CT de RdRP y carga viral en 56 muestras pareadas de HNF y saliva en pacientes sintomáticos según los días de evolución al momento del diagnóstico
| Días de síntomas | CT en HNF promedio ± DE | CT en saliva promedio ± DE | IC 95% valor p | Carga viral HNF (Log, copias/mL) promedio ± DE | Carga viral de saliva (Log, copias/ml) promedio ± DE | IC 95% valor p |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0-3 | 20,83 ± 5,7a (n = 37) | 26,84 ± 5,68b (n = 35) | 3,33 a 8,69 p < 0,0001 | 7,65 ± 1,56c | 5,98 ± 1,59d | -2,41 a −0,93 p < 0,0001 |
| 4-7 | 23,1 ± 5,53 (n = 15) | 28,71 ± 4,63 (n = 15) | 1,80 a 9,42 p = 0,0053 | 7,1 ± 1,61 | 5,46 ± 1,35 | -2,75 a −0,52 p = 0,0053 |
| > 7* | 30,01 ± 5,21a (n = 4) | 32,36 ± 1,61b (n = 4) | p = 0,482 | 5,08 ± 1,52c | 4,4 ± 0,47d | p = 0,4857 |
aDiferencia estadística entre el valor de CT de HNF de los primeros 3 días y > 7 días de síntomas p = 0,0132.
bdiferencia entre el valor de CT en saliva de los primeros 3 días y > 7 días de síntomas p = 0,0252;
cdiferencia entre la CV de HNF de los primeros 3 días y > 7 días de síntomas p = 0,0119;
ddiferencia entre la CV de saliva de los primeros 3 días y > 7 días de síntomas p=0,0308.
*Para la comparación estadística de promedios con la serie de > 7 días se utilizó la prueba paramétrica Mann-Whitney.
Discusión
El avance de la pandemia ha exigido que los servicios de salud cuenten con métodos capaces de diagnosticar oportunamente los casos y que se puedan aplicar a gran escala. La posibilidad de uso de la saliva como muestra alternativa al HNF para el diagnóstico del SARS-CoV-2, surge al principio de la pandemia tomando en cuenta que en las glándulas salivales existen receptores ACE2, utilizados por el virus SARS-CoV-2 para su entrada a las células, teniendo en ellas una replicación activa10. La presencia del virus SARS-CoV-2 se ha demostrado en diferentes fluidos distintos de las vías respiratorias, siendo mayor en saliva, lágrimas y cerumen11.
Varios estudios han evaluado el rendimiento de RTqPCR utilizando saliva en el intento de favorecer el uso de esta muestra para el diagnóstico de COVID-193,4,12–14. Los estudios iniciales se realizaron en pacientes hospitalizados3,15,16, pero dada la necesidad de identificar oportunamente a los individuos infectados en la comunidad, se ha estudiado también en pacientes ambulatorios. Los resultados son variables, pero demuestran una menor sensibilidad en saliva en comparación con HNF, oscilando entre 51 y 94%4,12–14,16–20. En el presente estudio, basado en pacientes ambulatorios y población principalmente sintomática, demostramos una sensibilidad de 91%, de acuerdo con los resultados de Kandel y Marx, quienes reportaron una sensibilidad de 85,2 y 91%, respectivamente19,21.
La menor sensibilidad de RT-qPCR utilizando saliva puede estar determinada por la menor carga viral en este fluido en comparación con el HNF. En nuestro estudio, la saliva tuvo un CT promedio 3,99 más alto y una carga viral estimada al menos 18 veces menor que en HNF, lo que ha sido observado por varios autores18,19,22. Sin embargo, hubo un 18% de muestras en que la carga viral fue mayor en saliva, aunque sólo en la mitad de ellos la diferencia fue mayor a 1 Log, valor considerado significativo generalmente. Esta diferencia puede estar dada por aspectos pre-analíticos del procedimiento como la variabilidad entre individuos, días de evolución de enfermedad, calidad de la muestra de HNF y la variabilidad normal de la excreción viral en los sujetos, describiéndose cambios más dinámicos en la carga viral del HNF que en la saliva en el tiempo14. La carga viral en HNF cuando la saliva fue negativa, fue menor en comparación con la carga viral en HNF cuando ambas muestras fueron positivas. Cuando el HNF tuvo un CT ≥ 30 y la carga viral < a 115.000 copias/ml, un tercio de las muestras de saliva fueron negativas, lo que significa que, cuando la carga viral en la nasofaringe es baja, un tercio de los casos de COVID-19 se podrían perder usando saliva. Esta proporción puede parecer significativa cuando se considera el uso de saliva como muestra para el diagnóstico de COVID-19. En los intentos de correlacionar el aislamiento viral con la carga viral, se observó que no hay replicación viral en muestras con una carga viral inferior a 1 × 106 copias/ml y valores de CT superiores a 24 o 34. La positividad del cultivo disminuye a medida que los valores de CT aumentan. Se ha visto que menos de 3 a 8% de las muestras con CT ≥ 35 muestran replicación viral en cultivo celular pudiendo considerarse infecciosas23–25. La persistencia del virus viable depende de la duración de la infección. Un estudio observó que, en pacientes asintomáticos con RPC positiva más allá de los 20 días desde el diagnóstico inicial, ninguno tenía cultivos positivos de SARS-CoV-226. El estudio de Hiroi mostró que los pacientes con CT > 30 y más de 10 días de síntomas tenían cultivo viral negativo27. Por lo tanto, es muy poco probable que los pacientes con COVID-19 diagnosticados por HNF positivo y con RPC negativa en saliva, situación en que la carga viral es baja, sean infectantes. Encontramos que los casos de COVID-19 que se pierden al usar saliva, corresponden principalmente a pacientes con cargas virales bajas en sus tractos respiratorios superiores, por debajo del umbral para ser considerados infecciosos y por lo tanto contagiosos. En consecuencia, desde el punto de vista de la transmisión, la menor sensibilidad observada en las muestras de saliva en comparación con el HNF no sería relevante.
Otros factores que pueden afectar a la sensibilidad de la RT-PCR en la saliva son la presencia, tipo y duración de los síntomas. La sensibilidad de la RT-PCR en pacientes sintomáticos es mayor, disminuyendo de 94,7 a 88% en pacientes asintomáticos28; sin embargo, las cifras no son tan diferentes cuando se compara entre sujetos asintomáticos y oligosintomáticos29. La diferente sensibilidad de la RT-PCR en sintomáticos vs asintomáticos se debe probablemente a la mayor carga viral presente en pacientes sintomáticos, ya sean niños o adultos28–31; sin embargo, esta diferencia entre sintomáticos y asintomáticos no parece ser tan clara en los niños32. A pesar de la menor sensibilidad en sujetos asintomáticos, la sensibilidad sigue siendo lo suficientemente alta, entre 78 y 91%, para la detección del virus, dependiendo de la frecuencia con que se realicen las pruebas. Con pruebas periódicas, al menos semanalmente, la detección de casos positivos mejora33. Algunos estudios incluso han demostrado que la RPC en saliva tiene una sensibilidad más alta que en el HNF para el tamizaje de pacientes asintomáticos, 92 y 86%, respectivamente34. Así, la saliva es una muestra adecuada para utilizar, ya sea para la vigilancia activa de los casos, tanto en adultos como en la población pediátrica, o para el diagnóstico en casos sospechosos de COVID-19. En nuestro estudio sólo tres de los 59 pacientes positivos eran asintomáticos y sólo uno dio positivo por saliva, por lo que no podemos sacar conclusiones sobre las diferencias en la carga viral entre estas dos poblaciones.
Otro determinante de la sensibilidad es la duración de los síntomas al momento del muestreo debido a la variación de la carga viral en el tiempo. A medida que aumenta el número de días desde el inicio de los síntomas, la carga viral disminuye. Se ha demostrado que la carga de SARS-CoV-2 disminuye después de siete días en comparación con los primeros tres días de síntomas, tanto en HNF como en saliva4,6,22,35. En nuestro estudio, observamos cargas virales más altas desde un día antes del inicio de los síntomas hasta tres días después, tanto en la saliva como en el HNF. También encontramos que la diferencia significativa en la carga viral entre saliva e HNF se observa durante los primeros siete días de síntomas, pero después de la primera semana esta diferencia tiende a desaparecer, siendo los promedios más similares entre HNF y saliva. Considerando que el número de muestras positivas con más de siete días de síntomas en nuestro estudio es muy pequeño, no es posible asegurar completamente que se pierde esta diferencia en el tiempo. Sin embargo, es posible que así ocurra, ya que otros autores han observado que hay una mayor reducción de la carga viral en la nasofaringe a lo largo del tiempo en comparación a la saliva14,17,22. La excreción del SARS-CoV-2 en la nasofaringe ha demostrado tener una duración más corta en comparación con otras muestras como el esputo, las heces y la orina, aunque no hay pruebas suficientes para compararlo con la saliva36.
En los sujetos del estudio, el síntoma más frecuente fue la mialgia, seguida de fiebre y tos. No hubo diferencias en las cargas virales (medidas como CT) entre estos síntomas, pero los pacientes que presentaron odinofagia en el momento del diagnóstico tenían una carga viral significativamente mayor en HNF, probablemente debido a una gran replicación a nivel faríngeo, lo que explicaría esta sintomatología. Chua y cols., encontraron que los niños con tos, expectoración y cefalea tenían cargas más altas31. Por otro lado, las cargas virales significativamente más bajas las observamos en los sujetos con síntomas gastrointestinales. No pudimos mostrar diferencias significativas en la carga viral de la saliva según la sintomatología. Por lo tanto, el tipo de síntomas al momento de la toma de muestra de un paciente también podría influir en la sensibilidad de la RPC.
Los métodos de recolección de saliva y el uso de medios de transporte también son factores que influyen en el rendimiento de la RPC de SARS-CoV-2. Utilizamos un método muy simple para recolectar la saliva que consiste en salivar en un tubo con medio de transporte. Métodos más complejos como la obtención de saliva con lavado orofaríngeo, la recogida de saliva en la boca durante 1 o 2 minutos, el carraspeo antes de la toma de muestras o el rollo de algodón, han mostrado una sensibilidad similar o incluso menor a la determinada por nosotros, 86%, 82,9% y 66,7%37–40. Descubrimos que recolectar saliva con un método simple como el salivar, sin dispositivos especiales, sin exigir un volumen mínimo, es tan bueno como los demás procederes y más fácil de realizar. Además, la mayoría de los participantes del estudio prefirieron el muestreo de saliva ya que era fácil de recolectar, no causaba molestia alguna y no los ponía nerviosos en comparación con el HNF. Por otro lado, demostramos que sólo se necesita un pequeño volumen de saliva para el buen rendimiento de la RT-qPCR, lo que es relevante para niños pequeños e incluso para adultos que, en su mayoría, pudieron recolectar menos de dos ml de saliva.
El uso de medios de transporte no ha demostrado ser relevante para la sensibilidad sino para el procesamiento, ya que la saliva recolectada sin medio de transporte agrega trabajo adicional y manipulación de las muestras para disminuir la viscosidad y prevenir la formación de coágulos. Sin embargo, los estudios en los que la saliva se recoge sin medio de transporte han demostrado una sensibilidad muy buena5,18,20. El uso o no de medios de transporte virales en la recolección de saliva podría ser un factor para considerar en los laboratorios que utilizan métodos de extracción automatizados en los que los canales pueden bloquearse con muestras de saliva muy espesas3,5,18. Según algunos autores, el uso de MTU al recolectar saliva, ofrece muchas ventajas sobre un HNF, porque no es invasivo, conveniente (especialmente para los niños), implica un trabajo mínimo y se presta bien para los programas de detección masiva y permite una mejor conservación de la muestra para fines de aislamiento viral41,42.
Conclusión
La saliva demostró ser una muestra comparable al HNF para el diagnóstico de casos de COVID-19 utilizando RT-qPCR. Este estudio valida la saliva como una muestra adecuada para la identificación de individuos contagiosos, por lo que recomendamos su uso. Sin embargo, considerando que este estudio se basó en una población adulta ambulatoria, donde prácticamente todos eran sintomáticos, las conclusiones sólo se pueden aplicar a este entorno de pacientes. De todos modos, su utilidad en poblaciones distintas a la aquí estudiada, como sujetos asintomáticos o pediátricos, se encuentra ampliamente validada en la literatura científica. Además, es fácil de recolectar, no corre el riesgo de quiebre de stock de materiales, no necesita personal capacitado, requiere pequeños volúmenes y se puede usar fácilmente en la población pediátrica. La saliva es probablemente una excelente muestra para niños e individuos que requieren vigilancia continua de COVID-19, favoreciendo la adherencia al muestreo.
