引用本文: 尤武林, 黄桂成, 王建伟. 微囊化转基因 BMSCs 移植修复兔早期激素性股骨头坏死实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(11): 1446-1453. doi: 10.7507/1002-1892.202003021 复制
激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH)是大剂量激素作用引起脂肪代谢紊乱、股骨头骨细胞变性、骨细胞有活力成分凋亡的病理过程[1-2]。目前治疗 SONFH 的方式较多,包括脉冲电刺激、高压氧治疗等非手术方法,以及髓芯减压、带或不带血管蒂骨瓣移植术等手术方法[3-5],但均未达理想疗效。如何有效防治 SONFH 是现阶段研究热点[6-7]。
采用微囊化组织或细胞移植是近年发展起来的一项新技术,它利用微囊的免疫阻隔作用以及半透膜特性,移植后可避免免疫排斥反应,同时发挥移植物的分泌功能等生物效应,达到治疗相关疾病的目的[8]。而海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(sodium alginate-poly-L-lysine-sodium alginate,APA)微囊具有半透性以及良好免疫隔离作用。BMSCs 具有强大的自我增殖能力和多向分化潜能,转基因 BMSCs 可定向成骨分化。Foxc2 是属于人类 forkhead 家族的一个重要转录因子,最初克隆于小鼠脑组织。过表达 Foxc2 的 BMSCs 具有较高的细胞活性,Foxc2 能促进 BMSCs 成骨分化,抑制其成脂分化。
微囊化转基因 BMSCs 对于诸多疾病的治疗意义重大,尤其对器官重建和损伤修复等疾病的治疗更具前景。转基因 BMSCs 微囊化后,因可持续分泌组织再生所需生长因子,微囊创造的三维环境为 BMSCs 生长和分化提供了有利场所。Ding 等[9]研究发现转染 BMP-2 基因的 BMSCs 微囊化后,能诱导成骨细胞分化。Paek 等[10]研究发现,微囊化转染 TGF-β1 基因的 BMSCs 能够长期分泌目的蛋白 3 周。目前微囊化转基因 BMSCs 技术在修复股骨头坏死领域尚未见报道。为此,本研究通过制备 APA 微囊化转基因 BMSCs,并移植至兔 SONFH 模型,观察其治疗作用,并分析可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2 月龄健康纯种新西兰大白兔 46 只,雌雄不限,体质量(3.0±0.3)kg,由南京中医药大学实验动物中心提供,实验前适应性喂养 1 周。
内毒素(Sigma 公司,美国);造模用甲基强的松龙琥珀酸钠(辉瑞公司,美国);抗人 Foxc2 一抗、二抗(Santa Cruz 公司,美国);抗兔骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、过氧化酶体增殖剂激活受体 γ 2(peroxisome proliferative activated receptor γ 2,PPARγ2)、VEGF、β-actin 一抗(Abcam 公司,美国);SP 法免疫组织化学试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)。万能电子材料试验机(济南捷德机械设备有限公司);H-7650 透射电镜(Hitachi 公司,日本);3.0T 超导型 MRI 扫描仪(GE 公司,美国)。
1.2 微囊化转基因 BMSCs 的制备
取 2 只新西兰大白兔,参照前期研究方法[11]制备 Foxc2 基因转染的 BMSCs。依据高压静电法[12]实验步骤,将 Foxc2 基因转染的 BMSCs 以 1.5% 海藻酸钠溶液重悬,调整细胞浓度至 1×106个/孔,加入注射器形成液滴,滴入 2.0%CaCl2 溶液中形成胶珠;置于 0.05% 多聚赖氨酸溶液中反应 5~10 min,浸入 0.03% 海藻酸钠溶液中 5~10 min,PBS 清洗,置于 55 mmol/L 柠檬酸钠溶液中使微囊液化,制备微囊化转基因 BMSCs。
1.3 微囊化转基因 BMSCs 成骨诱导培养及观察
将制备的微囊化转基因 BMSCs 以含 10%FBS 的 DMEM 培养液洗涤 2 次;将细胞沉淀以含 10%FBS 的 DMEM 培养液重悬,30 s 后加入培养瓶培养。以离心半径 8 cm、900 r/min 离心 5 min,弃上清,加入培养液重悬后滴入培养瓶。取出 5 mL 微囊化转基因 BMSCs 的 L-DMEM 培养液,加入 5 mL 破囊液破囊。将破囊后的微囊化转基因 BMSCs 按 1×104个/孔接种于 24 孔板中,置于 4℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养,培养 2 周后更换为成骨诱导培养基(含 1×10–8 mol/L 地塞米松、50 μg/mL 抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油钠的 DMEM 培养基),行成骨诱导分化培养。培养 2、3 周分别取培养板行茜素红染色,光镜下观察有无钙结节形成。
1.4 SONFH 模型制备及实验分组
1.4.1 SONFH 模型制备
取 40 只新西兰大白兔经耳缘静脉注射内毒素(10 μg/kg),24 h 后臀肌注射甲基强的松龙琥珀酸钠(20 mg/kg)3 次,每次间隔 24 h。实验过程中 4 只动物因腹泻、发热死亡。末次注射 6 周后剩余 36 只兔行 MRI 筛选,造模成功标准:符合早期 ONFH 影像学特征[13],其中 T1 加权像股骨头表现为片状或点状信号、T2 加权像表现为不规则片状高信号(图1)。共 32 只兔造模成功进行后续实验。
1.4.2 实验分组
将 32 只 SONFH 模型动物随机分为对照组(A 组)、髓芯减压组(B 组)、髓芯减压+BMSCs 组(C 组)及髓芯减压+APA 微囊化转基因 BMSCs 组(D 组),每组 8 只。另取 6 只正常兔作为正常对照组(E 组)。A 组模型动物不作任何处理。B、C、D 组采用 3% 戊巴比妥钠(25 mg/kg)腹腔注射麻醉,取双侧后肢股骨头进行髓芯减压处理,纵行切开大转子,切口长约 2 cm,沿外侧肌间隙进入,充分暴露股骨大粗隆端,透视下自大粗隆下沿股骨颈向股骨头中心钻入一直径 2.5 mm 斯氏针,深达关节软骨面下 1~2 mm。减压后,B 组于减压区注入 5 μL 生理盐水;C、D 组分别植入前期实验[14]培养的 5 μL 同种异体兔 BMSCs 及 APA 微囊化转基因 BMSCs,复合明胶海绵植入股骨头病灶,骨蜡封闭减压口,防止细胞溢出。术后连续 3 d 臀肌注射青霉素钠预防感染,每天注射 1 次,每次 2×105 U。
1.5 观测指标
1.5.1 一般情况
观察各组动物术后存活及肢体运动情况。
1.5.2 组织学观察
术后 6、12 周 A~D 组分别取 2 只动物,空气栓塞法处死后取双侧股骨头标本,置于 10% 中性甲醛缓冲液固定,脱钙、脱水、透明、包埋、切片,片厚 4 μm。取部分切片,常规 HE 染色,光镜下观察骨长入情况。
1.5.3 免疫组织化学染色观察
术后 6、12 周,取 A~D 组切片按 SP 法免疫组织化学染色试剂盒说明进行染色,光镜下观察 OCN、PPARγ-2 和 VEGF 蛋白表达,蛋白表达定位于细胞质及细胞膜,阳性染色呈棕黄色。各组每个股骨头随机选取 3 张切片,每张切片随机选取 10 个视野(×200),SP 法免疫组织化学分析灰度值,取均值。E 组取 3 只动物两侧股骨头制备切片进行染色观测。
1.5.4 透射电镜观察
术后 12 周,A~D 组分别取 2 只动物,同上法处死后,用刀片刮取 1 mm×1 mm×1 mm 大小股骨头软骨下区组织,对标本进行固定、脱钙,1% 锇酸后固定,树脂包埋,切片,片厚 4 μm。柠檬酸铝和醋酸铀进行染色,透射电镜观察组织超微结构。
1.5.5 生物力学测试
术后 12 周各组分别取 2 只动物,同上法处死后取双侧股骨头标本,切取带软骨下骨骨块及圆柱形垂直松质骨块各 1 块。游标卡尺测量软骨下骨骨块长 4.0 mm、宽 3.5 mm、高 3.0 mm,松质骨块长 4.0 mm、宽 3.0 mm、高 2.0 mm。所有标本用生理盐水持续冲洗,保持湿润,密封,−30℃ 保存。将标本固定于万能电子材料试验机支架上,加载速度为 5 mm/min,松质骨及软骨下骨均采用点压技术,压头外径为 2.54 mm,计算骨块的最大压缩强度及平均弹性模量。E 组取 3 只动物 6 个股骨头负重区骨块进行测量。
1.6 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD 检验;组内各时间点间比较采用独立样本 t 检验;检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 微囊化转基因 BMSCs 成骨诱导培养观察
诱导培养 2、3 周,茜素红染色后均可见钙结节形成,且 3 周时数量较 2 周时增加。见图2。
2.2 动物体内植入实验
2.2.1 一般情况
各组实验动物均存活至实验完成。激素注射后第 2 天,动物出现精神萎靡,进食量、活动量减少情况;1 周,动物体质量减轻,但进食量及四肢负重已恢复正常;4 周,动物精神、体质量、进食及四肢活动负重情况均正常;6 周,动物出现轻度跛行;8 周,动物跛行加重。
2.2.2 组织学观察
HE 染色示,A 组:骨坏死表现随时间延长逐渐加重,股骨头出现轻微塌陷。B 组:骨小梁稀疏,未见断裂,12 周时髓腔内脂肪细胞较 6 周时减少,骨细胞生成不明显。C 组:骨小梁排列尚规则,12 周时骨小梁内骨细胞较 6 周时略减少,脂肪细胞略增加,骨髓造血细胞减少,可见少量空骨陷窝。D 组:骨小梁排列较整齐,饱满致密,可见部分骨细胞形成,骨细胞核大居中,12 周时髓腔内脂肪细胞较 6 周时明显减少,空骨陷窝较少见,核固缩不明显。见图3。
2.2.3 免疫组织化学染色观察
术后 6、12 周,A、B、C 组 OCN 及 VEGF 表达均低于 D、E 组,B、C 组高于 A 组,E 组高于 D 组,差异均有统计学意义(P<0.05);B、C 组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C 组 PPARγ-2 表达均高于 D、E 组,A 组高于 B、C 组,D 组高于 E 组,差异均有统计学意义(P<0.05);B、C 组间差异无统计学意义(P>0.05)。A~D 组组内术后 6 周与 12 周间差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4 及表1。
2.2.4 透射电镜观察
术后 12 周,A 组骨细胞缩小,细胞核呈扭曲状态,核染色质固缩,呈块状,形成新月小体,细胞质内线粒体嵴断裂,而细胞器相对正常;B、C 组骨细胞周围的脂膜突起部分深入至骨小管内,核内有少量染色质浓集,细胞质内少量脂滴,核膜连续;D 组骨细胞占据整个骨陷窝,骨细胞周围突起较多,具有丰富的功能细胞器以及发达的粗面内质网和线粒体,嵴上可见细小颗粒,骨陷窝边缘以及邻近的骨基质可见有周期性横纹的胶原纤维出现。见图5。
2.2.5 生物力学测试
术后 12 周,D、E 组股骨头松质骨、软骨下骨平均弹性模量和最大压缩强度均高于 A~C 组,差异有统计学意义(P<0.05);A~C 组间及 D、E 组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。
3 讨论
BMSCs 具有较高可塑性及可移植性,能大量增殖、分化为多种组织细胞[14],易于接受和稳定表达外源目的基因,其不仅可以作为基因传送的载体,还可参与组织修复。早期已有研究进行动物实验向兔骨髓腔内注射自体 BMSCs 防治 ONFH 的报道[13]。国内外学者也尝试于减压孔处注射移植 BMSCs 治疗 ONFH,疗效满意[15-17]。目前认为此种疗法的原理主要是基于骨髓内的 BMSCs 具有成骨细胞分化潜能及活跃的增殖特性,可促进骨组织的修复。BMSCs 移植主要采用微创方法,包括髓芯减压、动脉灌注、联合填充材料及基因转染 BMSCs 移植。自体 BMSCs 移植虽不存在免疫排斥反应,但数量有限;同种异体 BMSCs 可解决来源不足的问题,但可能会发生免疫排斥反应[17]。
随着转基因技术的迅速发展,人们将微囊化技术和基因治疗结合,形成微囊化基因给药技术,利用基因重组干细胞产生的特定代谢产物来调节机体生理功能,治疗相关疾病。微囊化除了为干细胞生长提供良好的三维微环境,保证干细胞的体外大规模培养外,还可利用选择透过性膜将移植物与宿主免疫系统隔离,有效避免同种异体移植过程中的免疫排斥反应。BMSCs 向成骨细胞定向分化是一个复杂过程,体外的定向诱导体系应建立于体内转化机制的基础上,即体外模拟体内“成骨微环境”[18],才能获得具有正常生理功能的分化细胞。“成骨微环境”主要由成骨细胞、生长因子、细胞外基质等构成,其中成骨细胞是重要组成部分,它可分泌多种生长因子以及钙基质等,这些调节分子对 BMSCs 向成骨细胞定向分化具有重要的促进作用。转基因的 BMSCs 微囊化后,可持续分泌组织再生所需的生长因子。同时,共微囊化可利用其他细胞分泌的细胞因子促进干细胞分化,增加细胞间信号传导。微胶囊内细胞呈高密度生长,利于保持其正常分泌功能[8],并提高了囊内生长因子的浓度,使得囊内外浓度差增加,推动力增大,更有利于生长因子等向微胶囊外传递。Ding 等[9]报道微囊包裹转染 BMP-2 的 BMSCs 成骨分化诱导,结果表明微囊化转基因干细胞生长良好,能持续分泌 BMP-2 蛋白并促进干细胞向成骨细胞分化。Babister 等[19]将转 Sox-9 基因的人间质祖细胞用微囊包裹后移植入宿主体内,可以促进软骨结构的形成,预示其有用于治疗骨折和骨缺损等疾病的前景。
本研究提出一种非接触式微囊化转基因 BMSCs 体外定向分化为成骨细胞的新体系,利用微囊化转基因 BMSCs 诱导成骨治疗 SONFH。结果显示,术后 6、12 周 B、C 组只有较少新骨形成,12 周时减压孔道有纤维性骨痂形成,说明单纯髓芯减压及减压后干细胞移植均能产生少量新骨,延缓股骨头坏死;D 组均有明显成骨,12 周时坏死区被完全修复。术后 6、12 周,A~C 组 OCN 及 VEGF 表达明显低于 D 组,而 PPARγ-2 在 A 组表达最高、D 组最低,差异均有统计学意义。以上结果表明,微囊化转基因 BMSCs 能促进成骨、成血管因子表达,而抑制成脂因子表达。术后 12 周,D 组股骨头松质骨、软骨下骨的平均弹性模量和最大压缩强度均高于其他 3 组;透射电镜示 A 组标本内骨细胞体积缩小;D 组标本内骨细胞占据整个骨陷窝,具有丰富的功能细胞器;其余两组仅见骨细胞周围的突起部分深入到骨小管内。研究发现[20],Foxc2 可抑制前脂肪细胞的分化,机制可能与阻碍 PPARγ2活性有关。
综上述,利用微囊化转基因 BMSCs 移植干预早期兔 SONFH,可以有效延缓股骨头软骨下骨细胞凋亡及骨量减少的时间,一定程度上延缓了股骨头坏死,为早期 SONFH 治疗提供了一种新方法。但还有以下几个方面需要改进和深入研究:① 微囊化干细胞移植技术目前仍然停留在体外研究水平,体内研究仅限于动物实验阶段,离临床应用尚有一段距离;② 虽然我们制备的微囊能使细胞在囊内长期存活,但体内移植仍然面临微囊内细胞存活时间短、炎症细胞浸润和纤维化包裹的难题[21-22],对于微囊材料的选择及制备技术仍有很大的改进空间;③ 微囊化干细胞体内移植后,细胞的生长及分化或信号传导、调控研究较少;④ 对于安全性问题如微囊的回收效率、破损率等研究缺乏,动物实验时间相对较短,干细胞分化的具体机制尚不明晰。因此,对于移植后微囊和囊内干细胞在动物体内最终归宿、转化应深入研究。
作者贡献:尤武林负责科研设计、数据收集及具体实施;王建伟指导课题设计及实验;黄桂成负责科研设计、指导论文撰写。
利益冲突:所有作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题:研究方案经无锡市中医医院伦理委员会批准(SZYYKJ2019100801)。实验动物使用许可证批准号:SYXK(苏)2018-0049。
激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head,SONFH)是大剂量激素作用引起脂肪代谢紊乱、股骨头骨细胞变性、骨细胞有活力成分凋亡的病理过程[1-2]。目前治疗 SONFH 的方式较多,包括脉冲电刺激、高压氧治疗等非手术方法,以及髓芯减压、带或不带血管蒂骨瓣移植术等手术方法[3-5],但均未达理想疗效。如何有效防治 SONFH 是现阶段研究热点[6-7]。
采用微囊化组织或细胞移植是近年发展起来的一项新技术,它利用微囊的免疫阻隔作用以及半透膜特性,移植后可避免免疫排斥反应,同时发挥移植物的分泌功能等生物效应,达到治疗相关疾病的目的[8]。而海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(sodium alginate-poly-L-lysine-sodium alginate,APA)微囊具有半透性以及良好免疫隔离作用。BMSCs 具有强大的自我增殖能力和多向分化潜能,转基因 BMSCs 可定向成骨分化。Foxc2 是属于人类 forkhead 家族的一个重要转录因子,最初克隆于小鼠脑组织。过表达 Foxc2 的 BMSCs 具有较高的细胞活性,Foxc2 能促进 BMSCs 成骨分化,抑制其成脂分化。
微囊化转基因 BMSCs 对于诸多疾病的治疗意义重大,尤其对器官重建和损伤修复等疾病的治疗更具前景。转基因 BMSCs 微囊化后,因可持续分泌组织再生所需生长因子,微囊创造的三维环境为 BMSCs 生长和分化提供了有利场所。Ding 等[9]研究发现转染 BMP-2 基因的 BMSCs 微囊化后,能诱导成骨细胞分化。Paek 等[10]研究发现,微囊化转染 TGF-β1 基因的 BMSCs 能够长期分泌目的蛋白 3 周。目前微囊化转基因 BMSCs 技术在修复股骨头坏死领域尚未见报道。为此,本研究通过制备 APA 微囊化转基因 BMSCs,并移植至兔 SONFH 模型,观察其治疗作用,并分析可能作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
2 月龄健康纯种新西兰大白兔 46 只,雌雄不限,体质量(3.0±0.3)kg,由南京中医药大学实验动物中心提供,实验前适应性喂养 1 周。
内毒素(Sigma 公司,美国);造模用甲基强的松龙琥珀酸钠(辉瑞公司,美国);抗人 Foxc2 一抗、二抗(Santa Cruz 公司,美国);抗兔骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、过氧化酶体增殖剂激活受体 γ 2(peroxisome proliferative activated receptor γ 2,PPARγ2)、VEGF、β-actin 一抗(Abcam 公司,美国);SP 法免疫组织化学试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)。万能电子材料试验机(济南捷德机械设备有限公司);H-7650 透射电镜(Hitachi 公司,日本);3.0T 超导型 MRI 扫描仪(GE 公司,美国)。
1.2 微囊化转基因 BMSCs 的制备
取 2 只新西兰大白兔,参照前期研究方法[11]制备 Foxc2 基因转染的 BMSCs。依据高压静电法[12]实验步骤,将 Foxc2 基因转染的 BMSCs 以 1.5% 海藻酸钠溶液重悬,调整细胞浓度至 1×106个/孔,加入注射器形成液滴,滴入 2.0%CaCl2 溶液中形成胶珠;置于 0.05% 多聚赖氨酸溶液中反应 5~10 min,浸入 0.03% 海藻酸钠溶液中 5~10 min,PBS 清洗,置于 55 mmol/L 柠檬酸钠溶液中使微囊液化,制备微囊化转基因 BMSCs。
1.3 微囊化转基因 BMSCs 成骨诱导培养及观察
将制备的微囊化转基因 BMSCs 以含 10%FBS 的 DMEM 培养液洗涤 2 次;将细胞沉淀以含 10%FBS 的 DMEM 培养液重悬,30 s 后加入培养瓶培养。以离心半径 8 cm、900 r/min 离心 5 min,弃上清,加入培养液重悬后滴入培养瓶。取出 5 mL 微囊化转基因 BMSCs 的 L-DMEM 培养液,加入 5 mL 破囊液破囊。将破囊后的微囊化转基因 BMSCs 按 1×104个/孔接种于 24 孔板中,置于 4℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养,培养 2 周后更换为成骨诱导培养基(含 1×10–8 mol/L 地塞米松、50 μg/mL 抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油钠的 DMEM 培养基),行成骨诱导分化培养。培养 2、3 周分别取培养板行茜素红染色,光镜下观察有无钙结节形成。
1.4 SONFH 模型制备及实验分组
1.4.1 SONFH 模型制备
取 40 只新西兰大白兔经耳缘静脉注射内毒素(10 μg/kg),24 h 后臀肌注射甲基强的松龙琥珀酸钠(20 mg/kg)3 次,每次间隔 24 h。实验过程中 4 只动物因腹泻、发热死亡。末次注射 6 周后剩余 36 只兔行 MRI 筛选,造模成功标准:符合早期 ONFH 影像学特征[13],其中 T1 加权像股骨头表现为片状或点状信号、T2 加权像表现为不规则片状高信号(图1)。共 32 只兔造模成功进行后续实验。
1.4.2 实验分组
将 32 只 SONFH 模型动物随机分为对照组(A 组)、髓芯减压组(B 组)、髓芯减压+BMSCs 组(C 组)及髓芯减压+APA 微囊化转基因 BMSCs 组(D 组),每组 8 只。另取 6 只正常兔作为正常对照组(E 组)。A 组模型动物不作任何处理。B、C、D 组采用 3% 戊巴比妥钠(25 mg/kg)腹腔注射麻醉,取双侧后肢股骨头进行髓芯减压处理,纵行切开大转子,切口长约 2 cm,沿外侧肌间隙进入,充分暴露股骨大粗隆端,透视下自大粗隆下沿股骨颈向股骨头中心钻入一直径 2.5 mm 斯氏针,深达关节软骨面下 1~2 mm。减压后,B 组于减压区注入 5 μL 生理盐水;C、D 组分别植入前期实验[14]培养的 5 μL 同种异体兔 BMSCs 及 APA 微囊化转基因 BMSCs,复合明胶海绵植入股骨头病灶,骨蜡封闭减压口,防止细胞溢出。术后连续 3 d 臀肌注射青霉素钠预防感染,每天注射 1 次,每次 2×105 U。
1.5 观测指标
1.5.1 一般情况
观察各组动物术后存活及肢体运动情况。
1.5.2 组织学观察
术后 6、12 周 A~D 组分别取 2 只动物,空气栓塞法处死后取双侧股骨头标本,置于 10% 中性甲醛缓冲液固定,脱钙、脱水、透明、包埋、切片,片厚 4 μm。取部分切片,常规 HE 染色,光镜下观察骨长入情况。
1.5.3 免疫组织化学染色观察
术后 6、12 周,取 A~D 组切片按 SP 法免疫组织化学染色试剂盒说明进行染色,光镜下观察 OCN、PPARγ-2 和 VEGF 蛋白表达,蛋白表达定位于细胞质及细胞膜,阳性染色呈棕黄色。各组每个股骨头随机选取 3 张切片,每张切片随机选取 10 个视野(×200),SP 法免疫组织化学分析灰度值,取均值。E 组取 3 只动物两侧股骨头制备切片进行染色观测。
1.5.4 透射电镜观察
术后 12 周,A~D 组分别取 2 只动物,同上法处死后,用刀片刮取 1 mm×1 mm×1 mm 大小股骨头软骨下区组织,对标本进行固定、脱钙,1% 锇酸后固定,树脂包埋,切片,片厚 4 μm。柠檬酸铝和醋酸铀进行染色,透射电镜观察组织超微结构。
1.5.5 生物力学测试
术后 12 周各组分别取 2 只动物,同上法处死后取双侧股骨头标本,切取带软骨下骨骨块及圆柱形垂直松质骨块各 1 块。游标卡尺测量软骨下骨骨块长 4.0 mm、宽 3.5 mm、高 3.0 mm,松质骨块长 4.0 mm、宽 3.0 mm、高 2.0 mm。所有标本用生理盐水持续冲洗,保持湿润,密封,−30℃ 保存。将标本固定于万能电子材料试验机支架上,加载速度为 5 mm/min,松质骨及软骨下骨均采用点压技术,压头外径为 2.54 mm,计算骨块的最大压缩强度及平均弹性模量。E 组取 3 只动物 6 个股骨头负重区骨块进行测量。
1.6 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD 检验;组内各时间点间比较采用独立样本 t 检验;检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 微囊化转基因 BMSCs 成骨诱导培养观察
诱导培养 2、3 周,茜素红染色后均可见钙结节形成,且 3 周时数量较 2 周时增加。见图2。
2.2 动物体内植入实验
2.2.1 一般情况
各组实验动物均存活至实验完成。激素注射后第 2 天,动物出现精神萎靡,进食量、活动量减少情况;1 周,动物体质量减轻,但进食量及四肢负重已恢复正常;4 周,动物精神、体质量、进食及四肢活动负重情况均正常;6 周,动物出现轻度跛行;8 周,动物跛行加重。
2.2.2 组织学观察
HE 染色示,A 组:骨坏死表现随时间延长逐渐加重,股骨头出现轻微塌陷。B 组:骨小梁稀疏,未见断裂,12 周时髓腔内脂肪细胞较 6 周时减少,骨细胞生成不明显。C 组:骨小梁排列尚规则,12 周时骨小梁内骨细胞较 6 周时略减少,脂肪细胞略增加,骨髓造血细胞减少,可见少量空骨陷窝。D 组:骨小梁排列较整齐,饱满致密,可见部分骨细胞形成,骨细胞核大居中,12 周时髓腔内脂肪细胞较 6 周时明显减少,空骨陷窝较少见,核固缩不明显。见图3。
2.2.3 免疫组织化学染色观察
术后 6、12 周,A、B、C 组 OCN 及 VEGF 表达均低于 D、E 组,B、C 组高于 A 组,E 组高于 D 组,差异均有统计学意义(P<0.05);B、C 组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B、C 组 PPARγ-2 表达均高于 D、E 组,A 组高于 B、C 组,D 组高于 E 组,差异均有统计学意义(P<0.05);B、C 组间差异无统计学意义(P>0.05)。A~D 组组内术后 6 周与 12 周间差异均有统计学意义(P<0.05)。见图4 及表1。
2.2.4 透射电镜观察
术后 12 周,A 组骨细胞缩小,细胞核呈扭曲状态,核染色质固缩,呈块状,形成新月小体,细胞质内线粒体嵴断裂,而细胞器相对正常;B、C 组骨细胞周围的脂膜突起部分深入至骨小管内,核内有少量染色质浓集,细胞质内少量脂滴,核膜连续;D 组骨细胞占据整个骨陷窝,骨细胞周围突起较多,具有丰富的功能细胞器以及发达的粗面内质网和线粒体,嵴上可见细小颗粒,骨陷窝边缘以及邻近的骨基质可见有周期性横纹的胶原纤维出现。见图5。
2.2.5 生物力学测试
术后 12 周,D、E 组股骨头松质骨、软骨下骨平均弹性模量和最大压缩强度均高于 A~C 组,差异有统计学意义(P<0.05);A~C 组间及 D、E 组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。
3 讨论
BMSCs 具有较高可塑性及可移植性,能大量增殖、分化为多种组织细胞[14],易于接受和稳定表达外源目的基因,其不仅可以作为基因传送的载体,还可参与组织修复。早期已有研究进行动物实验向兔骨髓腔内注射自体 BMSCs 防治 ONFH 的报道[13]。国内外学者也尝试于减压孔处注射移植 BMSCs 治疗 ONFH,疗效满意[15-17]。目前认为此种疗法的原理主要是基于骨髓内的 BMSCs 具有成骨细胞分化潜能及活跃的增殖特性,可促进骨组织的修复。BMSCs 移植主要采用微创方法,包括髓芯减压、动脉灌注、联合填充材料及基因转染 BMSCs 移植。自体 BMSCs 移植虽不存在免疫排斥反应,但数量有限;同种异体 BMSCs 可解决来源不足的问题,但可能会发生免疫排斥反应[17]。
随着转基因技术的迅速发展,人们将微囊化技术和基因治疗结合,形成微囊化基因给药技术,利用基因重组干细胞产生的特定代谢产物来调节机体生理功能,治疗相关疾病。微囊化除了为干细胞生长提供良好的三维微环境,保证干细胞的体外大规模培养外,还可利用选择透过性膜将移植物与宿主免疫系统隔离,有效避免同种异体移植过程中的免疫排斥反应。BMSCs 向成骨细胞定向分化是一个复杂过程,体外的定向诱导体系应建立于体内转化机制的基础上,即体外模拟体内“成骨微环境”[18],才能获得具有正常生理功能的分化细胞。“成骨微环境”主要由成骨细胞、生长因子、细胞外基质等构成,其中成骨细胞是重要组成部分,它可分泌多种生长因子以及钙基质等,这些调节分子对 BMSCs 向成骨细胞定向分化具有重要的促进作用。转基因的 BMSCs 微囊化后,可持续分泌组织再生所需的生长因子。同时,共微囊化可利用其他细胞分泌的细胞因子促进干细胞分化,增加细胞间信号传导。微胶囊内细胞呈高密度生长,利于保持其正常分泌功能[8],并提高了囊内生长因子的浓度,使得囊内外浓度差增加,推动力增大,更有利于生长因子等向微胶囊外传递。Ding 等[9]报道微囊包裹转染 BMP-2 的 BMSCs 成骨分化诱导,结果表明微囊化转基因干细胞生长良好,能持续分泌 BMP-2 蛋白并促进干细胞向成骨细胞分化。Babister 等[19]将转 Sox-9 基因的人间质祖细胞用微囊包裹后移植入宿主体内,可以促进软骨结构的形成,预示其有用于治疗骨折和骨缺损等疾病的前景。
本研究提出一种非接触式微囊化转基因 BMSCs 体外定向分化为成骨细胞的新体系,利用微囊化转基因 BMSCs 诱导成骨治疗 SONFH。结果显示,术后 6、12 周 B、C 组只有较少新骨形成,12 周时减压孔道有纤维性骨痂形成,说明单纯髓芯减压及减压后干细胞移植均能产生少量新骨,延缓股骨头坏死;D 组均有明显成骨,12 周时坏死区被完全修复。术后 6、12 周,A~C 组 OCN 及 VEGF 表达明显低于 D 组,而 PPARγ-2 在 A 组表达最高、D 组最低,差异均有统计学意义。以上结果表明,微囊化转基因 BMSCs 能促进成骨、成血管因子表达,而抑制成脂因子表达。术后 12 周,D 组股骨头松质骨、软骨下骨的平均弹性模量和最大压缩强度均高于其他 3 组;透射电镜示 A 组标本内骨细胞体积缩小;D 组标本内骨细胞占据整个骨陷窝,具有丰富的功能细胞器;其余两组仅见骨细胞周围的突起部分深入到骨小管内。研究发现[20],Foxc2 可抑制前脂肪细胞的分化,机制可能与阻碍 PPARγ2活性有关。
综上述,利用微囊化转基因 BMSCs 移植干预早期兔 SONFH,可以有效延缓股骨头软骨下骨细胞凋亡及骨量减少的时间,一定程度上延缓了股骨头坏死,为早期 SONFH 治疗提供了一种新方法。但还有以下几个方面需要改进和深入研究:① 微囊化干细胞移植技术目前仍然停留在体外研究水平,体内研究仅限于动物实验阶段,离临床应用尚有一段距离;② 虽然我们制备的微囊能使细胞在囊内长期存活,但体内移植仍然面临微囊内细胞存活时间短、炎症细胞浸润和纤维化包裹的难题[21-22],对于微囊材料的选择及制备技术仍有很大的改进空间;③ 微囊化干细胞体内移植后,细胞的生长及分化或信号传导、调控研究较少;④ 对于安全性问题如微囊的回收效率、破损率等研究缺乏,动物实验时间相对较短,干细胞分化的具体机制尚不明晰。因此,对于移植后微囊和囊内干细胞在动物体内最终归宿、转化应深入研究。
作者贡献:尤武林负责科研设计、数据收集及具体实施;王建伟指导课题设计及实验;黄桂成负责科研设计、指导论文撰写。
利益冲突:所有作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题:研究方案经无锡市中医医院伦理委员会批准(SZYYKJ2019100801)。实验动物使用许可证批准号:SYXK(苏)2018-0049。